关于纳米抗体
ABOUT NANOBODY

新一代亲和纯化配基-Nanobody

最近几年纳米抗体在国内外非常火热,相信很多小伙伴都在从事纳米抗体制药,分子体内非侵入式分子成像,体外诊断等相关研究。我将给大家分享纳米抗体的又一应用---新一代纯化配基。亲和纯化亲和层析(Affinity Chromatography,AC)是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。可以说亲和层析技术是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一,也是最方便简单的方法。

纳米抗体作为亲和配基有哪些优势呢?

1.高特异性

理论上纳米抗体能够识别几乎所有靶标,因此可以制备针对每种蛋白的配基,纯化没有亲和标签的重组蛋白或者天然蛋白来说,这将大大降低纯化难度和成本,提高纯化得率。虽然传统抗体也能作为纯化配基,但是纯化时轻链易脱落导致二次污染。其次能用来纯化不同亚型的蛋白,如利用纳米抗体制备分识别乙肝表面抗原ad与ay的纳米抗体,来分离纯化ad与ay;纯化HCG的α链与β链

2。高亲和力

纳米抗体虽然是单域抗体,但是其亲和力与Fab,ScFV相比,没有差别,亲和力可达到nM~pM级。

3.结构稳定

因纳米抗体除了常见的FR1与FR3之间的二硫键外,CDR1或FR2与CDR3还有一对二硫键,因此其结构比较稳定,能够容忍高离子强度,有机溶剂,低pH值和高温。如有些抗原是脂溶性化合物,在纯化这类抗原时就需要配基能够容忍一定的有机溶剂,如利用纳米抗体制备黄曲霉毒素B1(AFB1),赭曲霉毒素(OTA)免疫亲和柱等。

4。多种结构形式

纳米抗体是通过基因工程的方法筛选得到的,因此可以知道其蛋白序列,这方便了抗体的改造,可以将抗体改造为双价,三价等,同时也能与多种融合蛋白一起融合表达,来达到实验的目的。

5。高载量

纳米抗体分子量小,能够在介质表面修饰时达到很高的比表面,提高了其载量。

新一代亲和纯化配基的筛选

纳米抗体主要来源于驼源和软骨鱼,通过免疫构建文库或者直接从天然文库中筛选binder的技术已经非常成熟了,在此就不在鳌述了。一些对pH值敏感的蛋白来说,筛选过程就显得特别重要了,如何控制筛选流程来获得能在温和条件下洗脱蛋白的binder,就需要研究者去探究了。其次还要去平衡亲和力与洗脱条件的关系。



应用举例

1. 抗体的纯化

商品化的抗体多采用protein A来纯化,但是protein A却有很强的情况依赖,如不能用来纯化IgG3;原料中的蛋白酶降解,导致protein A 脱落,引发免疫原性,引发抗体聚集;不能够容忍高盐离子强度等。Bio Affinity Company (Naarden, The Netherlands)利用纳米抗体开发了一系列亲和纯化填料- CaptureSelect ligands,与protein A 相比,该配基能在碱性条件下非常稳定且洗脱条件温和,根据抗体结构开发了一系列针对抗体恒定区的亲和纯化填料如CH1,CL,Fc,用来纯化不同条件下的抗体,如利用针对CH1 or CL区域的纳米抗体纯化Fab。该公司已经被ThermoFisher收购。


2。腺相关病毒纯化

在AVV产品中,残留的宿主细胞蛋白,牛血清蛋白,核酸酶或者核酸等杂质,不但会影响转染效果而且会引起免疫反应,为了得到较高纯度产品,经常需要将超速离心法,液相色谱法,化学试剂发和超滤发联合应用。但是这些方法往往步骤繁琐,成本高,得率低。POROS™ CaptureSelect™ AAV8 and AAV9 Resins 是基于纳米抗体的纯化介质,用来一步纯化获得高纯度的AAV8与AAV9。理论上可以针对AVV1,2,4,5,8,9等不同血清型载体,制备亲和纯化载体。


3.科研用Nano-traps

Nano-traps是德国chromotek公司推出的以驼源VHH为配基的亲和纯化介质,VHH 娇小 的个体 (直径 2。5 nm×高度 4 nm),使其能够以高密度牢固地结合于固相载体捕捉微量抗原,是传统抗体所不能比拟的。通过将VHH偶联到magic beads 与 agarose beads上,One step一步法完成IP /Co-IP /ChIP,让您的免疫沉淀更简易,更便捷,更可靠,更专业,无传统抗体的轻链和重链干扰。该产品具有:

√极端稳定

√70℃仍保持稳定,functionalin 2M NaCl or 0.5% SDS

√解离常数范围在nM内

√高特异性

√缩短孵化时间(只需5-30min)

√从细胞提取物或细胞器中定量分离融合蛋白及结合因子

√超低的非特异性结合影响

√无污染的普通抗体的轻链与重链





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